Sin embargo, a fines de la década de 1980, la microscopía confocal láser tiene un defecto importante: la apertura confocal no solo bloquea la fluorescencia generada fuera del punto focal, sino que también bloquea la fluorescencia generada por el punto focal que es dispersada por los tejidos biológicos. lo que da como resultado una disminución en la eficiencia de recolección de la fluorescencia, y la profundidad de la imagen no puede ser más de 100 micrómetros. Por lo tanto, en la década de 1990, surgió la microscopía de fluorescencia de dos fotones que combina la microscopía confocal láser y la tecnología de excitación de dos fotones. La longitud de onda de excitación del proceso de absorción de dos fotones generalmente se establece en el rango de la ventana bioóptica de 680-1080 nm, lo que evita el daño de la luz ultravioleta a las células o los organismos vivos y penetra más profundamente.
Actualmente, el microscopio de fluorescencia de dos fotones más utilizado es el láser de piedras preciosas de titanio de femtosegundo, que es voluminoso y costoso, lo que limita la aplicación de la microscopía de fluorescencia de dos fotones en varios campos, como las ciencias de la vida, la química y la medicina. Por lo tanto, en algunos campos, como el diagnóstico médico, la gente ha tratado de utilizar láseres de estado sólido de sub-nanosegundos compactos y asequibles como fuente de luz estándar.
El principio básico de la excitación de dos fotones es que, cuando una molécula fluorescente se excita bajo una alta densidad de fotones, absorbe simultáneamente dos fotones de longitud de onda larga y luego irradia espontáneamente fotones fluorescentes de vuelta al estado fundamental después de saltos de excitación y procesos de relajación. En comparación con la microscopía de fluorescencia de excitación de fotón único convencional, la generación de señales ópticas en la microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones no es lineal, siendo la luz de excitación una fuente de luz de mayor potencia máxima y longitud de onda más larga, y los fotones fluorescentes emitidos tienen una longitud de onda ligeramente más largo que la mitad de la longitud de onda de excitación.
La microscopía de fluorescencia de dos fotones utiliza una fuente de luz láser de infrarrojo cercano y su naturaleza no lineal no requiere una apertura confocal. Por lo tanto, en comparación con la microscopía confocal, la microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene las siguientes ventajas:
- Gran profundidad de imagen y bajo daño óptico;
- No se requiere una apertura confocal y la eficiencia de recolección de fluorescencia mejora considerablemente;
- Mayor resolución espacial y contraste;
- Pequeño rango de excitación, pequeña fototoxicidad y blanqueamiento;
- Las longitudes de onda de emisión y excitación están muy separadas, evitando la superposición espectral;
